成功传代培养的技巧:根据您的细胞系定制解离方法

在开发特定细胞系的培养条件时,需要考虑许多参数。我们都知道pH平衡,氧气水平和血清浓度是导致培养成功或失败的重要变量。然而,包括与细胞需要相匹配的解离方法的亚培养方案同样重要。考虑到这一点,我们将审查一些常见的解离实践背后的原理,以帮助您根据细胞系的特定性质定制您的方法。

悬浮生长的细胞易于亚培养。只要将细胞稀释到合适的新鲜培养基中,然后用完它们的营养供应,它们就会很好。另一方面,以单层生长的细胞彼此之间以及与培养皿发生蛋白质接触。必须先打破这些细胞,然后将细胞悬浮在培养基中,旋转并重新铺板。因此,必须特别考虑确保解离条件破坏细胞接触而不杀死细胞。

胰蛋白酶有时候,但并非总是如此

在决定解离条件时,研究者应考虑细胞产生的键的类型。一些贴壁细胞系仅产生微弱的接触,可以通过简单地将培养瓶撞击在您的手掌上,或通过将烧瓶轻敲在台面上来破坏。其他贴壁细胞系,特别是来自上皮细胞的贴壁细胞系,可形成强大的多蛋白质紧密连接,只能通过酶消化破坏; 在这些情况下,经常使用胰蛋白酶(丝氨酸蛋白酶)。来自上皮的细胞也可以表达钙粘蛋白,其介导非常强的钙依赖性粘附物或桥粒连接。在这种情况下,可能需要添加钙螯合剂(如EDTA)来螯合钙,以有效地解离细胞。

分离后优化活力

为了在解离后优化细胞活力,反应条件应与细胞接触的强度相匹配。例如,如果标准胰蛋白酶/ EDTA消化(通常0.05%-0.5%)不能有效消化细胞键(在10-15分钟内),则可能难以在细胞开始死亡之前从细胞中除去细胞,并且细胞活力将受到不利影响。在这种情况下,可能需要更高浓度的胰蛋白酶/ EDTA或其他酶,例如胶原酶。另一方面,如果反应太苛刻,细胞可能裂解或丢失重新附着到板上所需的表面蛋白质,并且任一情况都将导致活力降低。此外,裂解的细胞释放基因组DNA,导致活细胞结块,使存活细胞更难重新培养,并且需要添加DNase。

准备是良好分离的关键

如果您已将反应强度与细胞系的粘附特性相匹配,但您的细胞仍难以去除,您可能会发现问题在于细胞准备解离的方式。在生长培养基中可能存在抑制胰蛋白酶的元素,例如血清,但是这可以通过在添加解离试剂之前用Dulbecco's PBS(不含钙或镁)简单地冲洗细胞一次或两次来克服。也可能是细胞保持融合的时间过长。在这些条件下,细胞可能会形成特别强的细胞 - 细胞和细胞 - 表面连接,这些连接特别难以破碎。出于这个原因,以及培养物的整体健康状况,建议细胞在融合之前进行传代(即,

结论

通过对解离试剂的工作原理的基本了解,研究人员可以开发出一种优化的方案,该方案同时考虑细胞粘附性的强度和质量。优化的细胞解离方案将确保成功的传代培养并延长培养细胞的寿命。

 

Carolyn Peluso博士是ATCC的技术作家和细胞生物学专家。

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